首先從細胞培養開(kāi)始吧。我用的是A549，A549總體感覺(jué)還是好養的，也不嬌氣。A549的培養絕大多數的文獻都說(shuō)用1640，但是我的體會(huì )是用DMEM更好，因為經(jīng)高人指點(diǎn)，發(fā)現A549在偏減性環(huán)境長(cháng)得更好。一開(kāi)始也是用1640，細胞總是有部分漂起來(lái)，即便是用PBS洗后仍然會(huì )有部分漂浮。后來(lái)?yè)Q成DMEM,且血清最好用GIBCO的。以后細胞就開(kāi)始長(cháng)好了。這種細胞對濃度依賴(lài)更強，所以在傳得時(shí)候濃度要高一點(diǎn)，最好一傳二。最好是細胞鋪滿(mǎn)瓶底80-90%時(shí)，就傳。傳晚了細胞就疊層。有幾次傳稀了，細胞就集中在一些地方長(cháng)，沒(méi)有均勻的鋪展開(kāi)來(lái)。甚至細胞就在扎堆的地方疊層生長(cháng)，也不連接成片，這樣的細胞自然不能拿去接種。這樣就只能消化下來(lái)原瓶傳，以后細胞漸入佳境。
到快要接種前兩周，我基本上是一天傳一次。用于接種的細胞最好傳15代后再用，因為代數越高，活力越強，細胞生長(cháng)非常好。由于我的實(shí)驗接種的濃度較高，所以我用75cm2的瓶，整整養了99瓶?，F在回想起來(lái)，真不知當時(shí)是怎么熬過(guò)來(lái)的。主要是A549個(gè)頭較大，所以75cm2的瓶長(cháng)的滿(mǎn)滿(mǎn)的也就在106，如果按文獻5×107（大多數文獻），我接種60只，還得繼續擴大瓶數，不過(guò)我發(fā)現106數量級就非常好了，不一定必須是5×107。這或許跟我最后細胞的狀態(tài)有關(guān)。另外我發(fā)現A549更喜歡玻璃瓶，而且是玻璃瓶越小越好，不知是我的主觀(guān)感覺(jué)還是事實(shí)就是這樣。因為一開(kāi)始我是用玻璃瓶養，后來(lái)計算，發(fā)現用量需很大的量時(shí)，才改用75cm2的塑料瓶。
關(guān)于細胞養的過(guò)程中的一些細節：1）雙抗的配制：去一支80萬(wàn)單位的青霉素溶于4ml的NS，再取一支100萬(wàn)單位的鏈霉素溶于5ml的NS，取4ml與前者混合節。1ml分裝與1.5美麗的EP管，-20℃保存，臨用前再解凍。2）消化細胞胰酶最好用GIBCO的?？梢詫⒁让阜盅b在1.5ml的EP管里，每管1ml，-20℃保存，臨用前再解凍。3）完培、PBS、胰酶均沒(méi)必要提前溫浴，4℃拿出即可用。4）消化細胞時(shí)由于選用GIBCO的，所以沒(méi)必要在培養箱里消化，室溫即可。時(shí)間1分鐘左右。1ml的胰酶可以重復利用，可消化4瓶細胞，甚至可以消化6瓶，不過(guò)越到后面消化所需的時(shí)間就越長(cháng)。這樣對細胞不利，因為瓶里沒(méi)有完培了。當然消化之前必須用PBS洗。如果不洗的話(huà)，在吹打時(shí)就比較費時(shí)費力了。所以洗很關(guān)鍵，因為PBS液可帶走殘留的血清，以提高酶的活性。5）消化細胞時(shí)一定要掌握好火候，鏡下觀(guān)察到細胞連接松散了，即立即停止消化。吸走胰酶用于下一瓶的消化。6）加入完培吹打，此時(shí)可沿瓶底快速擠入完培，如果手勁夠大的話(huà)幾乎不用吹細胞都已經(jīng)掉下來(lái)了。吹打時(shí)間竟可能短一些，氣泡少一些。對于A(yíng)549來(lái)說(shuō)，可以快速地吹一二十次即可，因為GIBCO的胰酶消化效果非常好。不過(guò)反復使用后，應該適當延長(cháng)消化時(shí)間，且盡可能的把PBS吸干凈。7）加好完培后輕輕晃一下培養瓶，放入培養箱培養。特別提醒，首次復蘇的細胞，不要總去動(dòng)它，可以第5天再去換液。因為剛復蘇的細胞較嬌嫩，不易頻繁去動(dòng)它（新手容易犯這樣的錯誤）。
和多數文獻一樣接種后A549是有些長(cháng)的慢，我的實(shí)驗在第18天時(shí)，60只里有48只到達遴選標準（100-300mm3），剩下20只，有2/3較小、1/3超過(guò)均不能用。我自認為接種成功率比較高了，當然這得益于我身邊有一位近40年經(jīng)驗的高人。許多人接種率不高的原因，我個(gè)人體會(huì )是，除了與你的瘤株的活性（無(wú)論你是體外培養，還是體內培養）有密切關(guān)系外，還有就是動(dòng)物的周齡，我個(gè)人體會(huì )最好4周，動(dòng)物買(mǎi)來(lái)后適應1天就接種。還有后期管理也很重要，特別是NS組，有些人就不給NS，認為沒(méi)必要，其實(shí)很重要，NS組瘤重平均值應該在2g-3g，標準差應在平均值的1/3-1/4，否則數據根本就不可信，實(shí)驗就是白做。決定成功率的還有一個(gè)關(guān)緊因素是，接種部位，這個(gè)非一日之功。我的成功率較高（姑且自詡一下），正如我前面所說(shuō)，身邊有高人太重要了。所以在這里斗膽建議大家在做類(lèi)似實(shí)驗時(shí)，身邊一定要有高人指點(diǎn)，否則你可能會(huì )走很多彎路，這樣寧可不做。無(wú)論你是用什么鼠，在接種時(shí)，首先就是如何抓動(dòng)物。在抓動(dòng)物時(shí)每一只的手法和力量要盡量一致，抓好后把動(dòng)物側面面向自己，此時(shí)小鼠的身體呈一弧形，整個(gè)側面的皮膚繃緊。用小手指先壓住尾巴，再把右后肢向尾部反向拉一下（注：左手抓動(dòng)物），再用無(wú)名指壓住右后肢。此時(shí)整個(gè)小鼠的、用來(lái)注射的側面的皮膚已經(jīng)繃得較緊了。這樣做的目的是保證細胞懸液在注射后都集中在比較小的區域，不至于四處擴散，反而使局部的濃度減少，影響到成瘤和瘤塊的均一性（不過(guò)均一的瘤塊是可遇不可求的一件事?。?。大家可能覺(jué)得裸鼠掌握不好注射部位，因為裸鼠的皮膚彈性差。其實(shí)裸鼠更好注射，因為裸鼠體表無(wú)毛，皮膚是看的見(jiàn)的，有沒(méi)有在皮下很容易感覺(jué)得到。反而是其他有毛的小鼠看不見(jiàn)皮膚，需要小心一點(diǎn)。
進(jìn)針點(diǎn)的選擇你可以選離腋窩大概1.5cm的地方。如果我們從腋窩沿身體的側面（正俯位的右側）貼著(zhù)軀體表面與軀體平行劃一根線(xiàn)的話(huà)。那么進(jìn)針點(diǎn)就應該選在離腋窩1.5cm、“線(xiàn)”的左側。針頭進(jìn)去后應該斜向下（偏右方向）到達腋窩空曠的地方，剛好是6號針頭的2/3(注意：針頭不能太小，否則易堵。有一次我用4號就有點(diǎn)堵，當時(shí)是瘤塊的勻漿。)。之前肯定要消毒干凈，而且面積大一些好點(diǎn)。因為畢竟裸鼠免疫力低。細胞懸液最好注射在腋窩離得腋下靜脈叢周?chē)?，且不要傷及靜脈。聽(tīng)起來(lái)好像很懸吧，其實(shí)做多了，感覺(jué)就來(lái)了。這樣就會(huì )保證你每只都接種成功。皮下接種最好選擇腋下，因為這里血流豐富，可保證瘤塊很好的生長(cháng)。
在無(wú)菌室制備好的細胞懸液，最好用一無(wú)菌的玻璃瓶（一定要帶膠塞）裝好，再置于冰面上，再帶到動(dòng)物房注射。許多教科書(shū)多說(shuō)，從消化細胞開(kāi)始到制備成懸液，再到接種最好在30min內結束，我覺(jué)得這有點(diǎn)不切實(shí)際。如果是接種一兩動(dòng)物是可以做到的，但幾十只時(shí)，無(wú)論是什么樣的高手也做不到。以我為例，我接種60只，我養了99瓶細胞，我從上午8點(diǎn)開(kāi)始處理細胞，一直到下午3點(diǎn)才把細胞懸液制備好（3個(gè)人分工協(xié)作），反而是接種只花了30min。
在接種細胞時(shí)，每一只動(dòng)物的用量一定要統一，且注射器在吸得時(shí)候也一定要非常準確，這對于將來(lái)的成瘤影響很大。每次吸時(shí)一定要充分混勻，且搖的次數都要一樣，千萬(wàn)不要小看這些細節。由于裸鼠的皮膚彈性有些差，所以當完成注射，將針頭拔出時(shí)會(huì )有明顯的針眼，因此在注射完懸液和拔針之前最好下壓針頭，以免液體從針眼處流出，導致注射的量減少，使瘤塊不均一。當然注射前的消毒工作一定要做好，這毋庸置疑。特別是脫碘時(shí)一定要干凈，否則會(huì )將碘帶入裸鼠體內，那你就只有哭了。裸鼠太嬌貴了。
接種使用組織瘤塊好，還是細胞好。要根據你的模型需要決定。我用的A549移植瘤模型就應該選“細胞”，因為A549成瘤慢。如果用“組織瘤塊”的話(huà)，可能要花3個(gè)周期（每個(gè)周期20天左右，體內必須傳3代后才能用。如果有現成的成瘤裸鼠賣(mài)的話(huà)就另當別論了，買(mǎi)來(lái)就可以用。）
