小鼠顱頂前骨細胞亞克隆14(MC3T3E1 Subclone14)介紹：從克隆的但是表型各異的MC3T3-E1 細胞系中分離出一系列亞克隆。從含抗壞血酸培養基生長(cháng)的成骨細胞中選擇高或低成骨細胞分化、礦化的亞克隆。MC3T3亞克隆4（ATCC CRL-2593）和MC3T3 亞克隆14（ATCC CRL-2594）在抗壞血酸和3 到4mM 無(wú)機磷酸鹽中生長(cháng)表現出高水平的成骨細胞分化。它們10 天后形成一個(gè)礦化良好的細胞外基質(zhì)（ECM）。MC3T3 亞克隆24（ATCC CRL-2595)和MC3T3亞克隆30(ATCC CRL-2596)在抗壞血酸中生長(cháng)表現出很差的成骨細胞分化。不形成ECM，可以作為亞克隆4 和14 的陰性對照。礦化的亞克隆選擇的表達作為成骨細胞標記的mRNA，及唾液酸糖蛋白(BSP)，骨鈣素(OCN)，和甲狀旁腺激素/甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白受體的mRNA。高或者低的分化潛能的亞克隆在培養中生產(chǎn)出相似數量的膠原質(zhì)，表達可比較的基本水平的mRNA 編碼Osf2/Cbfa1，一種成骨細胞相關(guān)轉錄因子。植入免疫缺陷小鼠以后，高分化性的亞克隆形成與骨類(lèi)似的形成小骨的編織骨，低分化細胞只是產(chǎn)生纖維組織。這些細胞系是研究體外成骨細胞分化的好模型，尤其是ECM 信號。它們和原代培養顱頂成骨細胞的行為類(lèi)似。

小鼠顱頂前骨細胞亞克隆14(MC3T3E1 Subclone14)特性：

1） 來(lái)源：顱頂骨

2） 形態(tài)：成纖維細胞

3） 含量：>1x106 個(gè)/mL

4） 污染：支原體、細菌、酵母和真菌檢測為陰性

5） 規格：T25 瓶或者1mL 凍存管包裝

運輸和保存：可選擇干冰運輸及發(fā)送復蘇存活細胞方式：

（1）干冰運輸，收到后立即轉入液氮凍存或直接復蘇；

（2）存活細胞，收到后應繼續生長(cháng)，傳代達到細胞生長(cháng)狀態(tài)良好時(shí)，再進(jìn)行凍存。具體操作見(jiàn)細胞培養步驟。

小鼠顱頂前骨細胞亞克隆14(MC3T3E1 Subclone14)用途：僅供科研使用。

小鼠顱頂前骨細胞亞克隆14(MC3T3E1 Subclone14)培養步驟：

一．小鼠顱頂前骨細胞亞克隆14(MC3T3E1 Subclone14)培養基及培養凍存條件準備：

1）準備MEMα培養基(MEMα，GIBCO，貨號12561-056); 北美胎牛血清(UnitedStates，GIBCO，貨號16000-044)，10%。

2）培養條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37 攝氏度，培養箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%完全培養基，10%DMSO，現用現配。液氮儲存。

二．細胞處理：

1） 復蘇細胞：將含有1mL 細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL 培養基混合均勻。在1000RPM 條件下離心4 分鐘，棄去上清液，補加1-2mL 培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養瓶中培養過(guò)夜（或將細胞懸液加入10cm 皿中，加入約8ml 培養基，培養過(guò)夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養。

對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：

1. 棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS 潤洗細胞1-2 次。

2. 加2ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于37℃培養箱中消化1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀(guān)察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加少量培養基終止消化。

3. 按6-8ml/瓶補加培養基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM 條件下離心4 分鐘，棄去上清液，補加1-2mL 培養液后吹勻。

4. 將細胞懸液按1：2 到1：5 的比例分到新的含8ml 培養基的新皿中或者瓶中。

3）細胞凍存：待細胞生長(cháng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細胞凍存。貼壁細胞凍存時(shí)，棄去培養基后加入少量胰酶，細胞變圓脫落后，加入約1ml 含血清的培養基后加入凍存管中，再添加10%DMSO 后進(jìn)行凍存。

注意事項：

1. 收到細胞后，若發(fā)現干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。

2. 所有動(dòng)物細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內操作，并請注意防護，所有廢液及接觸過(guò)此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。