一、細胞永生化介紹、

  細胞永生化（Cell immortalization）是指體外培養的細胞經(jīng)過(guò)自發(fā)的或受外界因素的影響從增殖衰老危機中逃離，從而具有無(wú)限增殖能力的過(guò)程。正常組織來(lái)源的細胞在通常的體外培養條件下可分裂生長(cháng)，但經(jīng)過(guò)有限次數的傳代后，就會(huì )停止增殖，發(fā)生衰老和死亡。利用基因轉染等技術(shù)將外源性永生化基因導入目的細胞內，從而建立永生化細胞株，以達到使體外培養的細胞具有無(wú)限增殖能力且細胞間無(wú)差異的目的。對細胞永生化進(jìn)行深入研究，不僅有利于我們了解細胞增殖與衰老的分子機制，而且為探尋腫瘤治療及器官移植的研究奠定了堅實(shí)的基礎。此外，由于永生化細胞具有可以多次傳代的特性，可以利用各種細胞永生化的方法使那些傳代困難、增殖緩慢、容易衰老的細胞獲得永生，從而為研究人員提供更多的細胞資源。

二、永生化細胞株的建立方法

  由于體外培養細胞自發(fā)性永生化率非常低，目前普遍采用基因轉染技術(shù)將外源性永生化基因導入目的細胞內, 以增加永生化。永生化相關(guān)的外源基因。

以SV40過(guò)表達慢病毒為例：

1．轉染

（1）將細胞接種6孔板，每孔細胞數約為1×105 個(gè)，

（2）第二天，待細胞貼壁后，換液，

（3）加入1mL完全培養基，再加20 μL SV40過(guò)表達慢病毒，

（4）混勻后繼續培養，

（5）12h后觀(guān)察細胞狀態(tài)，并更換為新鮮培養基，

（6）當細胞長(cháng)滿(mǎn)板底后，傳代至T25培養瓶中。

2.篩選

2.1殺滅曲線(xiàn)的確定

（1）將未轉染的干細胞按每孔0.05million鋪入24孔板，孵育過(guò)夜，

（2）第二天，除去24孔板中舊的培養基，

（3）將含不同濃度嘌呤霉素（1ug/mL，2ug/mL，3ug/mL，4ug/mL，5 ug/mL，6ug/mL，7ug/mL）的新鮮培養基加入已鋪有細胞的24孔板，

（4）每2天更換新鮮的篩選培養基，

（5）每天觀(guān)察細胞的存活比例，

（6）最小的嘌呤霉素使用濃度就是從嘌呤霉素篩選開(kāi)始1-4d內殺死所有細胞的最低篩選濃度。

結果：嘌呤霉素的使用濃度為2ug/mL，作用時(shí)間為3d。

2.2嘌呤霉素篩選轉染細胞

（1）第一天，將轉染的細胞按每孔0.05million鋪入24孔板，孵育過(guò)夜

（2）第二天，除去24孔板中舊的培養基，

（3）加入含嘌呤霉素（2ug/mL）的篩選培養基，孵育，

（4）每2天更換新鮮的篩選培養基，

（5）每天觀(guān)察細胞的存活比例，

（6）在同一時(shí)間點(diǎn)（3d）存活的細胞，即為轉染成功的細胞，

（7）對篩選后的細胞進(jìn)行擴增。

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