細胞培養的核心之一是無(wú)菌操作,那么，菌從何而來(lái)?從人、物品以及環(huán)境中來(lái)。使用一次性、已滅菌的實(shí)驗工具，能有效降低污染引入的風(fēng)險，但總有一些工具、總有一些環(huán)節是需要反復使用的。而這就需要進(jìn)行清潔和滅菌。

Part1

選擇滅菌方法的基本原則 :

常見(jiàn)的2種操作是高壓滅菌和過(guò)濾除菌,主要講一下這兩者的區別和注意事項.

滅菌方法的選擇主要基于物品在高溫下的穩定性,可抗高溫的物品例如玻璃、金屬、耐熱塑料(PTFE)可采用干熱滅菌;

熱穩定的液體可以采用濕熱滅菌,也就是高壓蒸氣滅菌;熱敏感的塑材可以用乙醇或射線(xiàn)滅菌;熱不穩定的液體可以采用過(guò)濾除菌。

Part2

高壓滅菌 

常見(jiàn)的高壓滅菌方法是，使用滅菌鍋加熱水提高溫度和壓力來(lái)完成，其實(shí)驗條件是將實(shí)驗工具所處的環(huán)境加熱至121°并維持至少20分鐘。

由于水蒸氣會(huì )滲透至整個(gè)空間，滅菌結束后需要有一個(gè)干燥的過(guò)程，高壓蒸汽滅菌適用于熱穩定的液體，例如水、鹽溶液、或一些成份對熱穩定的培養基；例如LB，同時(shí)，這種方法也適用于耐熱的塑料，不少離心管、移液器、吸頭、吸頭盒。都是可以通過(guò)高壓來(lái)滅菌的。

使用高壓滅菌需要注意2點(diǎn):1 將含有液體的玻璃器皿進(jìn)行滅菌，如果其使用塑料蓋密封，應在滅菌前擰松蓋子，以防滅菌過(guò)程發(fā)生爆炸;2 如果實(shí)驗工具需要后續用于無(wú)菌操作實(shí)驗，建議滅菌鍋所用的水使用無(wú)菌的超純水，因為滅菌過(guò)后，鍋內有可能存在凝結水，而后者可能會(huì )存在污染帶入的風(fēng)險。

Part3過(guò)濾除菌

對于不耐熱的液體，可以使用孔徑為0.1-0.2um的微孔過(guò)濾器除菌，過(guò)濾的方法分為正壓過(guò)濾和負壓過(guò)濾，區別在于正壓過(guò)濾大多通過(guò)外力推壓針筒，使目標液體通過(guò)濾器的濾膜后，雜質(zhì)或污染物留在膜上，液體過(guò)濾至新的容器內。負壓過(guò)濾是通過(guò)將容器外接一個(gè)泵，利用泵把容器內的空氣抽走，實(shí)現一個(gè)負壓的狀態(tài)，而液體則從容器上方往下透過(guò)濾膜流入容器內。

使用過(guò)濾除菌，同樣有幾點(diǎn)要注意 :從操作上看使用負壓過(guò)濾會(huì )簡(jiǎn)單不少，但由于泵在抽走空氣的同時(shí)，也會(huì )帶走容器內的二氧化碳，因此過(guò)濾后的溶液所處的環(huán)境的pH會(huì )提高。如果是一些對后續實(shí)驗有pH要求的液體，應該視情況補充二氧化碳進(jìn)容器內。但不管是正壓還是負壓，都需要對濾器進(jìn)行質(zhì)控檢測，確保濾膜的完整性。這個(gè)質(zhì)控操作有一個(gè)專(zhuān)有名詞這個(gè)質(zhì)控操作有一個(gè)專(zhuān)有名詞。具體操作是; 當正壓過(guò)濾完成后，所有液體已通過(guò)濾器時(shí)，提高壓力直至濾器流出物中形成氣泡，這就叫起泡點(diǎn)(bubble point)。它會(huì )在壓力是過(guò)濾壓力的兩倍多時(shí)出現，過(guò)濾壓力的數值可以參考產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。如果濾器在滅菌壓力(100kPa)，或更低壓力時(shí)出現起泡，那么代表該濾膜已經(jīng)穿孔。在這種情況下，任何已經(jīng)收集的濾出液都應該被認為是未滅菌的，需要重新過(guò)濾。同時(shí)應更換濾膜。有一些化學(xué)溶液會(huì )溶解濾膜，因此，如果要使用過(guò)濾除菌的話(huà)，應該要提前檢查濾膜材質(zhì)是否能兼容這種化學(xué)溶液，例如DMSO，不能使用PES材質(zhì)的濾膜進(jìn)行過(guò)濾。